单细胞研究对于理解决定细胞命运和功能的生物学过程和分子基础至关重要。而且，它可能以高效率和患者特异性增强基于细胞的疗法的革新，这是打破当前疗法中瓶颈的不可抗拒的必要。在过去的十年中，关键技术的蓬勃兴起，例如微流控“芯片实验室”平台和原子力显微镜（AFM）已将单细胞研究从最初的细胞概况“快照”发展为最新的动态单活细胞操作，从而进一步促进了它们的多样化应用在生物技术领域。其中，纳米移液器技术是一种很有前途的单细胞研究策略，它提供了一种具有高空间分辨率的有效原位单细胞操作平台，该平台将保留细胞微环境，而不是常规细胞裂解。纳米移液管的内腔为货物装载提供了狭窄的空间。在单细胞操作过程中，纳米移液器会在循环和跨膜过程中物理穿孔目标细胞并“消除”复杂生理环境的不利影响，从而扩大了其生物学用途，成为具有单分子精度的多功能工具。
作为低分纳米移液管方法基于单细胞和原位细胞的操作为阐明细胞内过程提供了可能，并可能有助于提高治疗效率和精度。年11月，华东理工大学张隽佶/田禾院士团队在《AngewandteChemieInternationalEdition》上发表了题为HighpreservationSinglecellOperationthroughaPhotoresponsiveHydrogelNanopipetteSystem的论文。他们提出一种光响应水凝胶-纳米移液器混合系统，可以实现具有高空间/时间分辨率和可忽略的细胞损伤的单细胞操作。该策略克服了纳米移液器单细胞研究中的长期障碍，因为在操作过程中始终使用高电势（~mV）或有机溶剂，这势必会对目标细胞造成干扰和损害。光触发系统可促进无电势，非侵入性单细胞注射，从而获得良好保留的细胞生存力（90％存活率）。此外，光驱动注射可以实现精确剂量可控的单细胞药物输送。作为概念验证，在相应的细胞系中证明了阿霉素的致死剂量大大降低（-fg/细胞），这表明基于光响应水凝胶-纳米吸管系统的潜在精密细胞治疗策略。
作者在这里报告通过成功地规避细胞损伤问题的无电势纳米移液器系统的突破，在高保存度的单细胞操作中取得了突破。为了实现这一目标，将设计简单，对光有反应的水凝胶集成到纳米移液器中，以提供水凝胶-纳米移液器混合系统（图1）。在可见光（φnm）照射下，会发生快速的凝胶-溶胶转变，并在不施加电势或使用有机溶剂的情况下驱动穿孔细胞的注入。因此，细胞存活率显着提高（90％的存活率）。值得注意的是，该策略允许高精度，剂量可控的单细胞药物递送，而目前这对于先进方法是难以捉摸的。因此，单个细胞内经典癌症药物阿霉素（Dox）的时间依赖性注射（7.94fL/s）和剂量定量（0-fg）已在不同细胞系中成功进行。
图1.a）由紫外线（nm）和可见光（φnm）引发的二噻吩乙烯（DTE）的光异构化和DTE-L-苯丙氨酸（LPF）水凝胶的光稳定化/去稳定化。b）通过水凝胶-纳米吸管系统进行光触发细胞注射的示意图。c）注射量随记录时间而变化。
为了进行有效的光控注射，水凝胶快速而独特的凝胶-溶胶转化是前提条件。作者设计并通过光致变色二噻吩乙烯（DTEc）和L-苯丙氨酸（LPF）的封闭异构体之间的1：1配比合成了一种简单的光可切换水凝胶。DTE是众所周知的光致变色材料家族，在紫外线/可见光照射下会发生快速且可逆的光异构化（图1a）。在存在DTEc的情况下，通过经典的加热-冷却胶凝过程形成了稳定的绿色水凝胶，该凝胶可以存储两个月以上，而在黑暗中不会降解。相反，用可见光（nm）照射稳定的DTEc-LPF水凝胶会产生准稳定的浅*色DTEo-LPF，它在不到1分钟的时间内解离（图1a，图2a），表明凝胶剧烈可见光激发后发生溶胶转变。通过流变学测量检查了DTEc-LPF水凝胶的光诱导机械性能（图2a），证明了凝胶-溶胶转变的光控特征。扫描电子显微镜（SEM）图像（图2b，插图）还提供了DTEc和LPF凝胶化的证据，因为观察到了高度交联的基质。
图2.a）流变学分析显示，可见光（lnm）照射下DTEc-LPF水凝胶（4mL）随时间变化的硬度变化。b）DTEc-LPF水凝胶（绿色实线，3.0mg/mL），DTEo（深色实线，4.0×10-5M）和DTEc（深色虚线，4.0×10-5M）在紫外光下的吸收在甲醇中照射紫外线（=nm）和可见光（nm）。c）从头算起DTEc-LPF的包装结构。
然后研究了这种水凝胶-纳米移液器系统随时间的注入和光触发释放过程的实时控制。注射的定量计算可以通过数学模型确定。通过锥形模型进行的分析揭示了在最初的s内进样量与时间之间的线性关系（图3a），其恒定流量Q=7.94fL/s。这种线性关系有助于在负载的水凝胶光解离后精确控制剂量。之后流量开始减慢。此外，还可以通过光刺激实时调节货物的运送过程。间隔5s，10s和20s的其他光照射脉冲导致流出速率以不同程度急剧增加（图3c），表明光触发了通过纳米移液管的递送加速。1分钟后，所有增强的流出量逐渐恢复到初始速率（图3b）。
图3.a）辐射（nm，2分钟）后的前s中基于纳米吸管的注射流速的拟合曲线。b）增加体积的斜率（％）除以时间（s）和可见光的附加照射时间（nm）。c）额外照射5秒钟可见光后，随着时间（s）体积变化（％）增加。
在下一步中，进行了光触发的具有实时性和剂量可控精度的单细胞药物释放。由于巨噬细胞和A在肿瘤转移中的重要性42和在基于细胞的疗法中的代表性43,44，因此将它们选为靶细胞。首先检查了光控制策略的高度保留。在可见光的照射下对含水凝胶的纳米移液器（无Dox）进行预处理会引起流动，然后在开始运送货物时将纳米移液器打入选定的单元中。令人高兴的是，在大气环境下40分钟后，甚至进行了fL的注射（1分钟），超过90％的注射细胞仍保持了活力（吞噬作用活跃）（图4a和4c，视频2）。与巨噬细胞相比，另一种选择的细胞系A细胞表现出更高的生存能力。注入的细胞在大气条件下经过fL的纯水凝胶注入4h后仍保持活力（参见视频3）。以上结果证明了该光控纳米移液器注射策略的高度保留以及负载的水凝胶的低细胞*性的坚实证据。
图4.a）注射纯水凝胶（60s，fL）后沿时间的细胞活力b）注射不同量的载有药物的水凝胶后，细胞随时间的活力。c）注射fL载药的水凝胶（橙色）和fL纯水凝胶（*色）后的细胞活力。
参考文献：doi.org/10./anie.13011
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