大肠及其上皮上的隐窝阵列和各种管腔内含物可调节整个人体的体内平衡。在3D形状的水凝胶支架上由原代人肠道上皮干细胞形成的体外隐窝可复制体内隐窝的功能和结构特征。提供了胶原蛋白支架组装方法，以及使这些水凝胶成形以匹配体内隐窝的尺寸和密度所必需的微细加工和软光刻方案。此外，还提供了干细胞放大方案，因此，即使是超小的原始样品也可以用作起始材料。最初，将这些细胞以增殖单层的形式播种在成形支架上，并以干细胞/增殖细胞的形式进行培养，以使它们扩增并以隐窝状结构覆盖支架表面。为了将这些未成熟的隐窝转化为具有基础干细胞生态位和腔内分化细胞区的完全极化的功能单元，整个隐窝形成了稳定的线性生长因子梯度。该平台支持在整个隐窝中形成化学梯度，包括生长和分化因子，炎性化合物，胆汁和食物代谢产物以及细菌产品的化学梯度。所有微细加工和设备组装步骤预计需要8d，原代细胞培养12d才能形成成熟的体外隐窝。相关论文题为Invitrogenerationofself-renewinghumanintestinalepitheliaoverplanarandshapedcollagenhydrogels由华盛顿大学NancyL.Allbritton教授团队发表在《NatureProtocols》上。
总过程
由于在体外肠上皮细胞的培养和分析中存在长期障碍，作者开发了一种支撑主肠上皮细胞单层的异型支架，以概括体内小肠隐窝的功能和结构特征。该平台提供了肠道的微型3D生理模拟，适用于已建立的分析测定和高含量信息获取。该实验步骤将详细介绍用于制造3D形状的水凝胶支架和设备盒的微制造和软光刻方法，以及在每个设备中实现肠上皮的完整模拟所必需的相应的原代细胞培养方法（图1）。
图1协议的工作流程和时间表。D，体外隐窝的培养日。
上述每种肠道模型都有其自身的优点和局限性（图2）。通常，通过使用类器官模型可以轻松进行高通量增殖，细胞*性和生存力分析，因为它们很容易以标准化的96孔板形式生成。然而，类器官不足以进行运输，代谢，分泌和感染的研究，单层培养系统结合多孔膜由于其可接近的腔室和基底腔而更加适合。高含量的图像采集也更容易在细胞的平面单层上执行，因为它们消除了对多平面成像和z堆栈图像重建的需求。MPS平台通常比类器官系统或单层培养系统更为先进，因此更适合于专门研究，在这些研究中，可用的独特数据证明在其设置和执行方面投入了更多的精力。
图2原代肠上皮细胞体外培养平台的比较。
原代肠上皮细胞的单层培养和传代
1如果从冷冻保存的隐窝或培养细胞开始，则将MM在37°C的水浴中孵育30分钟，或直至温热。
2将1×PBS，一个15ml锥形管和一个六孔板中和的胶原水凝胶支架转移到无菌生物安全柜中。
3从胶原蛋白支架上吸出缓冲液，将其用于电镀（1小瓶/孔）。分配4ml的1xPBS，孵育5分钟。再重复此过程两次（图3a）。
图3：单层水凝胶维持原代肠上皮细胞。
4从液氮存储器中取出冷冻保存的细胞或隐窝瓶。2分钟内解冻至室温。
5将每个解冻的小瓶4毫升MM分配到15毫升的锥形管中，然后解冻的细胞原液（1毫升/瓶）。
6在g（室温）下离心1分钟。弃去上清液，然后将沉淀重新悬浮在每个解冻的小瓶4ml的MM中。
7从将用于铺板的每个胶原蛋白支架中吸出1xPBS，然后将4mlMM中的细胞悬浮液转移到每个孔中。
8将装有细胞的胶原蛋白支架板放入潮湿的CO2培养箱中。
9每48小时（例如，第2、4、6天等）补充一次培养基。从每个孔中吸出用过的培养基，并分配4ml新鲜的37°CMM。
10当细胞准备通过（≥80％汇合）时，将MM和“解离缓冲液”在37°C的水浴中温育，或直至温热。从4°C的储存中取出胶原酶储备溶液（5,U/ml），并将其与1×PBS，一个15ml锥形管和在六孔板中制备的中和的胶原蛋白支架一起转移到无菌生物安全柜中。
11从新的胶原蛋白支架上吸出缓冲液，将细胞传给该支架。分配4ml的1xPBS，孵育5分钟。再重复此过程两次（图3a）。
12为每孔分配l胶原酶原液，该溶液将进入15ml锥形管中。
13从CO2培养箱中取出培养的细胞，然后从每个孔中转移1ml用过的培养基，并将其传到15ml锥形管中。吸出剩余的培养基。
14使用–1,l移液器吸头，沿胶原蛋白支架的周边刮擦，抵靠孔壁，以将水凝胶从板上移出。使用移液器尖端轻轻抬起支架，并将其转移到锥形管中（图3b）。
15使用5ml血清移液管，将胶原酶溶液与支架一起移液5至10次。在此过程结束之前，应将支架粗略分解并通过移液器吸头自由转移。
16使用P1微量移液器，将胶原酶溶液与支架一起移液10至20次。在此过程结束时，支架应更大程度地分解，并通过移液器吸头自由转移。
17在37°C下孵育10分钟。
18在g（室温）下离心细胞1分钟，然后检查沉淀。如果胶原蛋白层保留在细胞上方，请重悬沉淀并在37°C下再孵育1分钟。在g（室温）下再离心1分钟。
19从细胞沉淀中吸出上清液。
20将沉淀重悬于14ml的1xPBS中以冲洗细胞。
21以g离心细胞1分钟，并从沉淀物中吸出上清液。
22将沉淀重悬于l的“解离缓冲液”中。使用P微量移液器，通过上下移液20次来破碎细胞沉淀。
23在37°C下孵育5分钟。
24使用P微量移液器，上下移液40次，将细胞团块破碎成较小的碎片。
25对于每个将铺有细胞的新支架，在锥形管中加入4ml37°CMM。
26从每个新的胶原蛋白支架上吸取缓冲液，并将4ml细胞悬液分配到每个孔中。
27将装有细胞的胶原蛋白支架板放入潮湿的CO2培养箱中，每隔48小时用新鲜的MM补充培养基，直到下一次通过（图3c）。
2F隐窝主模板制作（光刻）
28依次用丙酮和异丙醇冲洗玻璃片，然后用压缩空气干燥（图4a）。
图4
29在设置为30W的等离子清洁器中对载玻片进行等离子处理10分钟，以消除任何残留的表面污染物并提高2F光致抗蚀剂的附着力。
30将清洁过的基材转移到旋涂机上。在玻片的中心上分配约2ml的2F-10光致抗蚀剂。以rpm的速度以rpm/s的速度将分散的2F-10散布在玻片上10s，然后以rpm/s的速度以3,rpm的速度旋转30s，最终膜厚为5m。
31软烘烤：将载玻片在设定为95°C的烤箱中孵育30分钟。
32通过使用准直的紫外线曝光系统，将整个薄膜曝光于1,mJ/cm2的紫外线下。
33曝光后烘烤：将载玻片在95°C的烤箱或热板上孵育10分钟，以使光酸引发环氧树脂的交联。
34硬烘烤：将载玻片在设定为°C的热板上再孵育30分钟，以硬化环氧膜（图4a）。
35从加热板上取下载玻片，然后冷却至室温。
36在设置为30W的等离子清洁器中对表面进行等离子处理10分钟，以清洁交联的2F表面污染物，并改善其他2F层的附着力。
37将基材转移到旋涂机上。在玻片的中心上分配约2ml的2F-光致抗蚀剂。以rpm的速度以rpm/s的速度将分散的2F-分散在载玻片上10s，然后以rpm/s的速度以1,rpm的速度旋转30s，以产生厚约m的薄膜。
38软烤：将载玻片在设定为95°C的烤箱中孵育2小时。
39再重复两次步骤37和38，以生成总共三层。多层2F膜的最终厚度为-m（图4a）。
40将基材转移到紫外线曝光系统中。用丙酮浸透的无尘室擦拭布擦去幻灯片背面（即玻璃暴露面）上的所有杂物。翻转基板并将2F涂层的一面朝下。然后放置光掩膜（图4），使掩膜的铬面朝下，与涂有光阻剂的载玻片的玻璃曝光面保形接触。将组件暴露在1,mJ/cm2的紫外线剂量下。
41曝光后烘烤：将玻片在95°C的烤箱中孵育30分钟，然后在°C的热板上孵育10分钟。
图5：用于体外隐窝的微加工和细胞培养插入物修饰。
42在定轨摇床上轻轻搅拌（约rpm），将其在丙二醇甲醚乙酸酯（PGMEA）显影剂中孵育60分钟进行显影。
43依次用PGMEA和异丙醇冲洗，然后用压缩空气干燥（图5a）。
44在处理过程中，碎屑可能会滞留在微柱中，可以通过使用PDMS将其清除。在一次性塑料称量盘中，将Sylgard硅酮弹性体基料和固化剂以10：1的重量比混合。用刮刀将溶液混合，然后在真空干燥器中脱气，直到气泡完全清除。在载玻片上分配约3ml的混合物，然后脱气，以除去滞留在微柱之间的气泡。将混合物在设定为95°C的烤箱中固化10分钟。剥去PDMS以清除残留的碎屑并丢弃。再重复一次此PDMS应用程序和分层过程。
45硬烤：将主模具在设定为°C的热板上孵育30分钟。
PDMS隐窝印章制作（软光刻）
46以10：1的重量比合并Sylgard有机硅弹性体基础剂和固化剂，然后对混合物脱气。
47在2F主模具上分配约3ml的PDMS混合物，然后脱气以除去微柱之间截留的气泡。
48将混合物在设定为95°C的烤箱中固化30分钟。
49从2F主模具上剥离PDMS副本。该脱模的PDMS具有一系列微孔（图5b）。
50将PDMS复制品放在载玻片上，用作固体支持物，微孔朝上，远离载玻片。确认PDMS和载玻片之间没有气泡。
51将步骤50中的玻璃/PDMS基板在设置为°C的热板上孵育2h，以使PDMS硬化。
52等离子清洗器中的等离子处理PDMS设置为30W，持续2分钟。该步骤在PDMS表面上产生氧化物层，以促进随后的硅烷附着。
53在化学通风橱中，将PDMS复制品转移到真空干燥器室中，并使微孔朝上。将l三氯（辛基）硅烷分配到位于腔室中央的直径15毫米的干净培养皿中。使用无油真空泵将腔室抽真空2分钟。关闭腔室的主阀并断开真空泵的连接。孵育16小时。
54缓慢将化学通风橱内的腔室排气。从反应室中取出带有硅烷残留物的培养皿，并丢弃。使用无油泵将腔室抽真空2分钟，然后排气。再重复两次真空/排气过程。
55在PDMS复制品上分配约2ml的Sylgard混合物（步骤46），然后脱气以除去微孔中截留的气泡。将混合物在设定为95°C的烤箱中固化10分钟。
56重复步骤55，直到达到所需的最终印章高度（再进行两次到三遍）。作者发现，使用镊子相对容易握持和操纵2到4毫米的高度。
57从PDMS副本中删除PDMS标记。脱模的PDMS压模具有与2F主模相同的微柱阵列（图5b）。具有微孔的PDMS复制品可用于约10种未来的邮票制造，此后开始出现皱纹和变形。
58通过在°C的热板上孵育30分钟来硬化PDMS印章。
59将PDMS印章冷却至室温，然后用剃须刀修剪至最终尺寸为4×4×2-4mm（长×宽×高；图5b）。
PDMS印章的表面处理
60重新准备“PEG光接枝溶液”（请参阅“试剂设置”）或从4°C的存储中取出原种。
61将PDMS印章（≤10）放置在圆底玻璃管中，并填充约50mlPEG接枝溶液。用PTFE螺帽密封。
62将玻璃管放入玻璃培养皿中进行支撑，然后转移到LoctiteW金属卤化物UV泛光系统平台上。暴露在≥J/cm2的紫外线辐射下（4小时洪水暴露）。
63用去离子水彻底冲洗印章，然后在去离子水中孵育过夜，以去除任何非共价连接的光接枝溶液组分。
64用75％（体积/体积）的乙醇冲洗，并储存在装有75％（体积/体积）的乙醇的锥形管中直至使用。
65使用切割工具从商用的12孔细胞培养插入物中（例如Transwell和Falcon）卸下预安装的膜。用去离子水清洗并用Kimwipe或压缩空气干燥（图5c）。
66从卷筒上展开胶带，放置插入物，并在插入物周围切开胶带/背衬，以使其与胶带卷或薄片分离。在插入物的内外边缘上用手工刀切开，注意只能切开粘合剂，而不能切开背衬。使用Kimwipe和/或镊子清除残留的粘合剂，然后丢弃。
67将涂有粘合剂的基础轮辋与新鲜的亲水PTFE膜（即Biopore）接触。朝着插入物的外壁折叠薄膜的任何悬垂区域，以促进薄膜，粘合剂和插入物基部之间的紧密密封。
68将转移粘合剂粘贴到聚碳酸酯薄膜上，使粘合剂背衬在粘合剂的一面上。切成约15毫米长的正方形，可在每个细胞培养插入物周围轻松操作。
69使用活检打孔器，在每个聚碳酸酯/胶粘剂方块的中心开一个直径为3毫米的孔。
70取下粘合剂背衬，并将3mm孔与细胞培养插入物的底部居中对齐。用力将表面压在一起。
71用工艺刀或剪刀修剪掉从刀片边缘伸出的所有剩余材料。
72将修饰的插入片段转移到12孔板中。
成型水凝胶支架的微成型
73从其储存溶液中取出PEG接枝的PDMS压模（步骤64），并在使用前干燥1小时。
74使用明场显微镜检查微柱。验证微柱特征中是否没有缺陷，并且没有灰尘，碎片和胶原蛋白（如果从先前的模制中重新使用印模）。如果有灰尘或碎屑，请在75％（体积/体积）的乙醇流下清洗邮票，干燥并再次检查。
75准备将用于形成成型水凝胶支架的胶原蛋白混合物。在冰上的微量离心管中合并50μl的0.6MEDC和50μl的0.15MNHS，并通过移液彻底混合。将μlMES溶解的胶原蛋白（5mg/ml，pH5）分配到同一容器中，并通过轻轻上下吹打40次进行混合。如果混合物中形成气泡，则在15,g（室温）下离心1分钟。
76在步骤72的每个经过修饰的细胞培养插入物中的腔室中央分配50μl胶原蛋白/EDC/NHS混合物（即，在直径3mm的扩散窗口正上方）。
77使用镊子，将PDMS微型柱状印章施加并压入每个插入物内的凝胶中，微型柱状体朝下。如果在印章和凝胶之间夹有任何可见的气泡，可以用镊子将印章提起并重新放置（图5c）。
78将带有PDMS模具的细胞培养插入物转移到12孔细胞培养板中（如果尚未放置），然后将其放入气动固化容器或压力罐中。
79从氮气源施加20psi（kPa）的压力。启动计时器5分钟，并保持有效的气体供应。升高的压力可消除交联水凝胶中的滞留气穴，并迫使粘性胶原蛋白混合物进入微柱空隙区域。
分钟后，终止气流并在培养箱中孵育盒2小时。在此期间，腔室将逐渐减压。
81在打开之前，打开腔室上的快速排气阀以排出所有残留气体。取出带有细胞培养插入物的12孔板。
82向每个插入物的腔室中加入1ml1×PBS，并孵育≥10分钟。
83用镊子小心地从每个细胞培养插入物中垂直提起每个PDMS印章。使用明场显微镜，验证每个胶原蛋白支架中是否存在微孔，且没有任何扭曲（图5c，d）。
84将细胞培养插入物转移到2升的去离子水容器中，以清洁残留的交联剂支架。在室温下孵育过夜。
85倒出容器中的去离子水，并添加足够的75％（vol/vol）乙醇溶液以覆盖细胞培养插入物。
86将带有细胞培养插入物的容器转移到无菌生物安全柜中，并在75％（体积/体积）乙醇溶液中孵育5分钟。
87将细胞培养插入物从容器转移到12孔细胞培养板中。将插入物中的乙醇溶液倒入2升容器中。
88在每个腔室中分配1ml的1xPBS，在每个基底室中分配2ml的1xPBS。盖上盖子孵育30分钟。
89从每个隔室中吸取溶液，并将与步骤88中相同的体积的新鲜PBS分配到每个隔室中。
90在将细胞传到成形的水凝胶支架上的前一天，将VitroCol人胶原蛋白在1xPBS中稀释至10g/ml的浓度。
91从细胞培养插入物的腔室和基底室吸出储存溶液。将1ml稀释的人类胶原蛋白溶液分配到每个腔室中，并将1ml的稀释的人类胶原蛋白分配到每个基底腔室中。在室温下孵育过夜。
体外人类结肠隐窝的培养
92用步骤91交联的胶原支架从细胞培养物的腔室和基底腔吸出人胶原蛋白溶液（即含有成形的隐窝结构）。在每个腔室中分配1ml的1xPBS，在每个基底室中分配2ml的1xPBS。在室温下孵育，直到准备好转移细胞为止。
93在水或珠浴中将EM，解离缓冲液和10mMY-储备液温育至37°C30分钟，或直至温热。从4°C的储存中取出胶原酶储备溶液（5,U/ml），并将其与1×PBS和一个15ml锥形管一起转移到无菌生物安全柜中。
94将初始电镀所需的EM的等分试样分配到50ml的锥形管中（向每个腔室中添加1mlEM，向每个基底室中添加2mlEM，每个总3ml细胞培养插入物）。将EM中的原液Y-稀释至10M的浓度。
95按照本协议的步骤10-23，从≥80％融合的中和胶原水凝胶支架中传代原代人类结肠上皮细胞。
96准备一个双移液器吸头以裂解细胞集落：在P微量移液器的末端放置一个2–l移液器吸头，然后在2–μl移液器的末端放置一个0.1–20l移液器吸头尖端（图6a）。
图6：体外隐窝的形成和特征。
97使用配备有双移液器吸头的P微量移液器，通过上下移液40次将细胞沉淀破碎成较小的碎片。
98将所需量的EM+Y-（每个腔室1ml）分配到碎片化的细胞悬液中。
99从细胞培养插入物中吸取具有一定形状的水凝胶支架的储存缓冲液（步骤92），从基底隔室开始，到腔腔室结束。
平板细胞重悬于EM+Y-中，进入每个细胞培养插入物的腔室中（每个腔室1ml）。将2mlEM+Y-（无细胞，从步骤94剩下）分配到每个基底隔室中。
将板转移到37°C的潮湿的CO2培养箱中。避免调整或干扰板直到第2天，以使细胞沉降到微孔的底部（图6b）。
每48小时用3ml新鲜的37°CEM（无Y-）补充培养基：吸出用过的培养基，并在第2、4天将1mlEM分配到每个腔室中，将2mlEM分配到每个基底室中（图6b）。
（可选）可以在扩增过程中的任何时候（第0天）固定并染色细胞的增殖生物标志物验证细胞在所有隐窝区域均保持增殖活性。
到第8天，肠道上皮细胞应在微模制胶原蛋白支架阵列中％汇合（图6b）。从每个隔室中吸出用过的EM，并通过将0.5ml的DM分配到每个腔室中以及将1.5ml的SM分配到每个基底隔室中，使体外隐窝极化进入茎/增殖性和分化型表型室。
（可选）可通过每24小时对培养基取样并定量基底和腔室中的Wnt3a，R-spondin和头蛋白来确认梯度形成。或者，可以使用40kDa的荧光右旋糖酐（g/ml）作为这些生长因子的替代物，并直接通过荧光进行测量。
（可选）为消除区室化，从而建立隐窝极化的阴性对照，可将DM或SM分别添加至基底腔和腔腔，从而分别形成被完全分化或干/增生细胞覆盖的隐窝支架。
（可选）可以向上或向下（从50％（体积/体积）滴定）调节SM中L-WRN条件培养基的水平，以沿隐窝长轴改变茎/增殖室的大小。
（可选）在此期间可以添加其他生长因子，代谢产物，药物和/或药理抑制剂，以引起所需的效果或测试实验假设。
每隔24小时从每个隔室中补充一次介质，持续4天：吸出用过的培养基，并在第9、10和11天将0.5ml的DM分配到每个腔室中，并将1.5ml的SM分配到每个基底室中。
分析体外隐窝和/或在第12天或以后（即化学梯度条件≥4d）对其进行化学固定以进行染色。图6c中图像的相应标记方法可在作者以前的出版物中获得。体外隐窝具有类似于体内组织的组织水平自我更新能力，可以这种方式培养≥32d（图6b，c）。
参考文献：doi.org/10.8/s---8
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